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                    疑難解析 | 2023年度直播答疑熱點匯總

                    更新時間:2024-01-16  |  點擊率:426


                    細胞培養過程中,我們通常會遇到各種各樣的問題,這些問題一般是多種因素造成的,如細胞密度、培養環境、操作方法等。2023年,普諾賽圍繞細胞培養問題,共舉辦了10場線上直播,吸引了萬余人觀看。直播期間,大家踴躍發言,提出了日常實驗中遇到的問題。本期直播答疑篩選出部分問題做了詳細解答。


                    牙源性干細胞培養時,血清會誘導分化嗎?

                    血清成份復雜,里面包含抑制分化的因子,也包含促進分化的因子;間充質干細胞一類成體干細胞大多可以用血清培養,單能干細胞,用血清不會分化;胚胎干會細胞分化。

                    血清的刺激分化主要與血清品質相關,品質高的可以維持干細胞增殖,抑制分化;品質較低的如新生牛血清會誘導分化;與生產批次也有關系,不同批次因子含量不一,分化效果不一。

                    ? 篩選品質高的血清批次;

                    ? 添加抑制分化的因子,如bFGF,EGF等;

                    ? 及時傳代,控制密度,刺激增殖,高密度會引起分化;

                    ? 及時換液,防止代謝累積,刺激分化;

                    ? 控制培養基質量如內毒素、支原體、pH等等,控制環境穩定。

                    LX2細胞培養有哪些需要注意的點?

                    細胞密度高的時候,消化3~4 min 才能完-全消化下來,細胞高密度下生長速度快,低密度下細胞增殖慢甚至死亡,建議傳代比例控制在1:2~1:4,不要超過1:4。

                    鏡下觀察,已經開始生長分化的細胞漂浮

                    很多是什么原因?

                    細胞分化了之后是不會再增殖的。細胞分化實驗前期,細胞還能緩慢增殖,但隨著實驗的進展,漂浮的細胞越來越多,這時候要分不同的情況處理:

                    ? 如果實驗前,細胞長得過滿,可能因為接觸抑制產生較多漂浮細胞。這種情況下,只要貼壁的細胞沒有受到影響,實驗可以繼續;

                    ? 另一種情況,是實驗開始時的密度合適,實驗開始后,貼壁的細胞慢慢脫落漂浮,這種情況是不正常的,需要結合實驗前細胞狀態、實驗所用的誘導試劑對細胞的影響等多方面的因素去調整。

                    NK-92細胞有些臟,怎么梯度離心呢?

                    正常培養的細胞系是沒有梯度離心這個概念的,梯度離心通常是用于細胞提取時,多種細胞混合在一起的一種分離措施。懸浮細胞培養的過程中會始終伴隨著細胞的死亡,細胞死亡后裂解就會產生碎片。這種可以通過低速離心(800 rpm,3~5 min)去除一部分,但無法完-全去除。

                    細胞的密度怎么判斷?

                    懸浮細胞需要計數來判斷。貼壁細胞可以看不同視野下細胞的密度,以大多數視野下的密度為準。需要注意的是,不是所有細胞都會平鋪單層,有些細胞可能會堆疊生長,比如Hep G2。

                    THP-1細胞貼壁了,是怎么回事呢?

                    THP-1是一類單核細胞,可以在特定的情況下分化為M0型的巨噬細胞,這時的細胞就是會貼壁的。培養的過程中如果發現細胞出現了貼壁的情況,傳代的時候可以只收集漂浮的細胞。同時排查實驗室的環境、培養基、血清等,看看有沒有什么特定的影響因素導致細胞貼壁。

                    NK-92越養活力越低,怎么辦?

                    細胞培養傳代次數多了,會存在狀態越來越差的情況??梢栽诩毎麪顟B好的時候,一邊傳代,一邊凍存。NK-92細胞有很強的IL-2依賴性,培養時要注意避免過度吹打,團塊吹散的同時,細胞也容易受損。培養過程中,一方面需要注意及時添加IL-2,一方面也需要注意吹打次數,一般輕輕吹2~3下將大團吹成小團就可以了。

                    貼壁細胞,會有一些亮晶晶像油一樣的東

                    西,這是污染了嗎?

                    需要結合具體的細胞及圖片具體分析。如果是一些有成脂能力的細胞,不排除是細胞培養的過程中受到某種刺激分化形成了脂滴。除此以外,還需要排除器皿本身的影響。最后結合顯微鏡下的圖片及視頻進行判斷,看是否有明顯微生物的痕跡。如果上述方法都無法判斷,必要時,可以收集細胞培養液置于37℃培養箱進行空培養,觀察是否有明顯的微生物增殖。

                    為什么復蘇后細胞就老化了?

                    細胞復蘇后老化,可能是因為細胞凍存前的狀態不佳,以及凍存時的保存活性效果不好,這些都會影響細胞狀態,其中凍存損傷影響比較常見。建議控制凍存前狀態、控制凍存過程及凍存液確保細胞活率。

                    誘導成脂肪細胞,只看形態嗎?需要其他

                    方法進行鑒定嗎?

                    一般誘導效果好,脂滴大,相差顯微鏡白光可以觀察到油滴,可能會存在誤判,建議使用標準檢測方法,用油紅O染色方法鑒定。

                    懸浮細胞怎么進行脂質體轉染?

                    懸浮細胞通常是當天按實驗所需細胞量接種細胞,后續配置轉染復合物,將轉染復合物滴加到培養基中,根據摸索好的轉染時間,收樣檢測。

                    DNA和siRNA共轉染如何操作?

                    設置好分組,空白對照、陰性對照、陽性對照、DNA、siRNA、DNA和siRNA共轉染(用無血清培養基稀釋DNA和siRN及DNA,無血清培養基稀釋轉染試劑),摸索適宜的濃度、比例、轉染時間。

                    懸浮細胞培養,易成團,如何盡量減少成

                    團?

                    大多數懸浮細胞培養時都會聚團,還有些懸浮細胞本身就是聚團長的,不聚團說明細胞活性較差,如NK-92細胞。培養本身是聚團生長的懸浮細胞,是不可以減少細胞團的。如果是存在少數聚團,大部分單顆懸浮的細胞,可以將細胞進行高密度培養.一般密度在200萬/mL時,細胞大部分是單顆分散的。

                    NCI-929細胞復蘇后很難養,細胞不增殖,

                    怎么辦?

                    這是一株對營養要求較高的懸浮細胞,培養的時候需要添加β-巰基乙醇。如果細胞剛復蘇就生長緩慢,可以先用臺盼藍染色檢測細胞的活性。如果是復蘇時生長狀態較好,但傳代后生長緩慢,可能是培養基的營養不夠,比如沒有加β-巰基乙醇等。另外,細胞不增殖可能與接種時的密度太低有關。懸浮細胞培養是有密度要求的,一般情況下密度控制在50-200萬/mL為佳,密度太低了,細胞增殖緩慢,密度太高了,細胞可能會慢慢裂解死亡。






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